¿Qué es CRISPR?

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La tecnología CRISPR es una herramienta simple pero poderosa para editar genomas. Permite a los investigadores alterar fácilmente las secuencias de ADN y modificar la función de los genes. Sus múltiples aplicaciones potenciales incluyen la corrección de defectos genéticos, el tratamiento y prevención de la propagación de enfermedades y la mejora de cultivos. Sin embargo, su promesa también plantea preocupaciones éticas..

En el uso popular, "CRISPR" (pronunciado "más nítido") es la abreviatura de "CRISPR-Cas9". Los CRISPR son tramos especializados de ADN. La proteína Cas9 (o "asociada a CRISPR") es una enzima que actúa como un par de tijeras moleculares, capaz de cortar hebras de ADN.

La tecnología CRISPR se adaptó a partir de los mecanismos de defensa naturales de las bacterias y arqueas (el dominio de los microorganismos unicelulares). Estos organismos usan ARN derivado de CRISPR y varias proteínas Cas, incluida Cas9, para frustrar los ataques de virus y otros cuerpos extraños. Lo hacen principalmente cortando y destruyendo el ADN de un invasor extraño. Cuando estos componentes se transfieren a otros organismos más complejos, se permite la manipulación de genes o la "edición".

Hasta 2017, nadie sabía realmente cómo era este proceso. En un artículo publicado el 10 de noviembre de 2017 en la revista Nature Communications, un equipo de investigadores dirigido por Mikihiro Shibata de la Universidad de Kanazawa e Hiroshi Nishimasu de la Universidad de Tokio mostró cómo se ve cuando un CRISPR está en acción por primera vez hora. [Un nuevo GIF impresionante muestra a CRISPR masticando ADN]

CRISPR-Cas9: los jugadores clave

CRISPR: "CRISPR "significa" grupos de repeticiones palindrómicas cortas regularmente interespaciadas. "Es una región especializada de ADN con dos características distintas: la presencia de repeticiones de nucleótidos y espaciadores. Las secuencias repetidas de nucleótidos, los componentes básicos del ADN, se distribuyen a lo largo de un CRISPR. región. Los espaciadores son fragmentos de ADN que se intercalan entre estas secuencias repetidas.

En el caso de las bacterias, los espaciadores se toman de virus que atacaron previamente al organismo. Sirven como un banco de recuerdos, lo que permite a las bacterias reconocer los virus y luchar contra futuros ataques..

Esto fue demostrado por primera vez de forma experimental por Rodolphe Barrangou y un equipo de investigadores de Danisco, una empresa de ingredientes alimentarios. En un artículo de 2007 publicado en la revista Science, los investigadores utilizaron Streptococcus thermophilus bacterias, que se encuentran comúnmente en el yogur y otros cultivos lácteos, como modelo. Observaron que después de un ataque de virus, se incorporaron nuevos espaciadores en la región CRISPR. Además, la secuencia de ADN de estos espaciadores era idéntica a partes del genoma del virus. También manipularon los espaciadores sacándolos o colocando nuevas secuencias de ADN viral. De esta manera, pudieron alterar la resistencia de las bacterias al ataque de un virus específico. Por lo tanto, los investigadores confirmaron que los CRISPR juegan un papel en la regulación de la inmunidad bacteriana..

ARN CRISPR (ARNcr): Una vez que se incorpora un espaciador y el virus ataca de nuevo, una parte del CRISPR se transcribe y se procesa en CRISPR RNA o "crRNA". La secuencia de nucleótidos de CRISPR actúa como molde para producir una secuencia complementaria de ARN monocatenario. Cada crRNA consta de una repetición de nucleótidos y una porción espaciadora, según una revisión de 2014 de Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier, publicada en la revista Science..

Cas9: La proteína Cas9 es una enzima que corta el ADN extraño..

La proteína típicamente se une a dos moléculas de ARN: crRNA y otra llamada tracrRNA (o "crRNA trans-activador"). Luego, los dos guían a Cas9 al sitio de destino donde hará su corte. Esta extensión de ADN es complementaria a un tramo de 20 nucleótidos del crRNA.

Usando dos regiones separadas, o "dominios" en su estructura, Cas9 corta ambas hebras de la doble hélice de ADN, haciendo lo que se conoce como una "ruptura de doble hebra", según el artículo de Science de 2014..

Hay un mecanismo de seguridad incorporado, que garantiza que Cas9 no solo corte en cualquier parte del genoma. Las secuencias cortas de ADN conocidas como PAM ("motivos adyacentes al protoespaciador") sirven como etiquetas y se ubican junto a la secuencia de ADN diana. Si el complejo Cas9 no ve un PAM junto a su secuencia de ADN objetivo, no cortará. Esta es una posible razón por la que Cas9 nunca ataca la región CRISPR en bacterias, según una revisión de 2014 publicada en Nature Biotechnology.

CRISPR-Cas9 como herramienta de edición del genoma

Los genomas de varios organismos codifican una serie de mensajes e instrucciones dentro de sus secuencias de ADN. La edición del genoma implica cambiar esas secuencias, cambiando así los mensajes. Esto se puede hacer insertando un corte o rotura en el ADN y engañando a los mecanismos naturales de reparación del ADN de una célula para que introduzcan los cambios que uno desea. CRISPR-Cas9 proporciona un medio para hacerlo.

En 2012, se publicaron dos artículos de investigación fundamentales en las revistas Science y PNAS, que ayudaron a transformar CRISPR-Cas9 bacteriano en una herramienta de edición genómica simple y programable..

Los estudios, realizados por grupos separados, concluyeron que Cas9 podría dirigirse a cortar cualquier región de ADN. Esto podría hacerse simplemente cambiando la secuencia de nucleótidos del crRNA, que se une a una diana de ADN complementaria. En el artículo de Science de 2012, Martin Jinek y sus colegas simplificaron aún más el sistema fusionando crRNA y tracrRNA para crear un único "RNA guía". Por lo tanto, la edición del genoma requiere solo dos componentes: un ARN guía y la proteína Cas9..

"Desde el punto de vista operativo, se diseña un tramo de 20 pares de bases [nucleótidos] que coinciden con un gen que se desea editar", dijo George Church, profesor de genética en la Escuela de Medicina de Harvard. Se construye una molécula de ARN complementaria a esos 20 pares de bases. Church enfatizó la importancia de asegurarse de que la secuencia de nucleótidos se encuentre solo en el gen objetivo y en ningún otro lugar del genoma. "Entonces el ARN más la proteína [Cas9] cortará, como un par de tijeras, el ADN en ese sitio, e idealmente en ningún otro lugar", explicó..

Una vez que se corta el ADN, los mecanismos de reparación natural de la célula se activan y funcionan para introducir mutaciones u otros cambios en el genoma. Esto puede suceder de dos formas. Según el Proyecto de Alcance de Huntington en Stanford (Universidad), un método de reparación implica volver a pegar los dos cortes. Este método, conocido como "unión de extremos no homólogos", tiende a introducir errores. Los nucleótidos se insertan o eliminan accidentalmente, lo que resulta en mutaciones que podrían alterar un gen. En el segundo método, la ruptura se arregla llenando el espacio con una secuencia de nucleótidos. Para ello, la célula utiliza una hebra corta de ADN como plantilla. Los científicos pueden proporcionar la plantilla de ADN de su elección, escribiendo así cualquier gen que deseen o corrigiendo una mutación..

Utilidad y limitaciones

CRISPR-Cas9 se ha vuelto popular en los últimos años. Church señala que la tecnología es fácil de usar y es aproximadamente cuatro veces más eficiente que la mejor herramienta de edición del genoma anterior (llamada TALENS).

En 2013, los primeros informes del uso de CRISPR-Cas9 para editar células humanas en un entorno experimental fueron publicados por investigadores de los laboratorios de Church y Feng Zhang del Instituto Broad del Instituto de Tecnología de Massachusetts y Harvard. Los estudios que utilizan modelos in vitro (laboratorio) y animales de enfermedades humanas han demostrado que la tecnología puede ser eficaz para corregir defectos genéticos. Ejemplos de tales enfermedades incluyen fibrosis quística, cataratas y anemia de Fanconi, según un artículo de revisión de 2016 publicado en la revista Nature Biotechnology. Estos estudios allanan el camino para aplicaciones terapéuticas en humanos.

"Creo que la percepción pública de CRISPR está muy centrada en la idea de usar la edición de genes clínicamente para curar enfermedades", dijo Neville Sanjana del Centro del Genoma de Nueva York y profesor asistente de biología, neurociencia y fisiología en la Universidad de Nueva York. "Esta es sin duda una posibilidad emocionante, pero es sólo una pequeña pieza".

La tecnología CRISPR también se ha aplicado en las industrias alimentaria y agrícola para diseñar cultivos probióticos y vacunar cultivos industriales (para yogur, por ejemplo) contra virus. También se utiliza en cultivos para mejorar el rendimiento, la tolerancia a la sequía y las propiedades nutricionales..

Otra aplicación potencial es la creación de impulsores genéticos. Se trata de sistemas genéticos que aumentan las posibilidades de que un rasgo particular se transmita de padres a hijos. Eventualmente, en el transcurso de generaciones, el rasgo se propaga a poblaciones enteras, según el Instituto Wyss. Los impulsores genéticos pueden ayudar a controlar la propagación de enfermedades como la malaria al mejorar la esterilidad entre el vector de la enfermedad: femenino Anopheles gambiae mosquitos, según el artículo de Nature Biotechnology de 2016. Además, los impulsores genéticos también podrían usarse para erradicar especies invasoras y revertir la resistencia a pesticidas y herbicidas, según un artículo de 2014 de Kenneth Oye y sus colegas, publicado en la revista Science..

Sin embargo, CRISPR-Cas9 no está exento de inconvenientes.

"Creo que la mayor limitación de CRISPR es que no es cien por ciento eficiente", dijo Church. Además, las eficiencias de edición del genoma pueden variar. Según el artículo de Science de 2014 de Doudna y Charpentier, en un estudio realizado en arroz, la edición de genes se produjo en casi el 50 por ciento de las células que recibieron el complejo Cas9-RNA. Considerando que, otros análisis han demostrado que, según el objetivo, las eficiencias de edición pueden alcanzar el 80 por ciento o más..

También existe el fenómeno de los "efectos fuera del objetivo", en el que el ADN se corta en sitios distintos del objetivo previsto. Esto puede conducir a la introducción de mutaciones no deseadas. Además, Church señaló que incluso cuando el sistema corta el objetivo, existe la posibilidad de no obtener una edición precisa. Llamó a esto "vandalismo genómico".

Establecer límites

Las muchas aplicaciones potenciales de la tecnología CRISPR plantean preguntas sobre los méritos éticos y las consecuencias de la manipulación de los genomas..

En el artículo de Science de 2014, Oye y sus colegas señalan el posible impacto ecológico del uso de impulsores genéticos. Un rasgo introducido podría extenderse más allá de la población objetivo a otros organismos a través del cruzamiento. Los impulsores genéticos también podrían reducir la diversidad genética de la población objetivo.

La realización de modificaciones genéticas en embriones humanos y células reproductoras, como los espermatozoides y los óvulos, se conoce como edición de la línea germinal. Dado que los cambios en estas células pueden transmitirse a las generaciones posteriores, el uso de la tecnología CRISPR para realizar ediciones de la línea germinal ha planteado una serie de preocupaciones éticas..

La eficacia variable, los efectos fuera del objetivo y las ediciones imprecisas plantean riesgos de seguridad. Además, hay mucho que aún desconoce la comunidad científica. En un artículo de 2015 publicado en Science, David Baltimore y un grupo de científicos, especialistas en ética y expertos legales señalan que la edición de la línea germinal plantea la posibilidad de consecuencias no deseadas para las generaciones futuras "porque existen límites para nuestro conocimiento de la genética humana, las interacciones gen-ambiente, y las vías de la enfermedad (incluida la interacción entre una enfermedad y otras afecciones o enfermedades en el mismo paciente) ".

Otras preocupaciones éticas tienen más matices. ¿Deberíamos hacer cambios que podrían afectar fundamentalmente a las generaciones futuras sin su consentimiento? ¿Qué pasa si el uso de la edición de la línea germinal pasa de ser una herramienta terapéutica a una herramienta de mejora para diversas características humanas??

Para abordar estas preocupaciones, las Academias Nacionales de Ciencias, Ingeniería y Medicina elaboraron un informe completo con pautas y recomendaciones para la edición del genoma..

Aunque las Academias Nacionales instan a la cautela al buscar la edición de la línea germinal, enfatizan que "precaución no significa prohibición". Recomiendan que la edición de la línea germinal se realice solo en genes que conducen a enfermedades graves y solo cuando no existan otras alternativas de tratamiento razonables. Entre otros criterios, enfatizan la necesidad de tener datos sobre los riesgos y beneficios para la salud y la necesidad de una supervisión continua durante los ensayos clínicos. También recomiendan hacer un seguimiento de las familias durante varias generaciones..

Investigación reciente

Ha habido muchos proyectos de investigación recientes basados ​​en CRISPR. "El ritmo de los descubrimientos de la investigación básica se ha disparado, gracias a CRISPR", dijo el bioquímico y experto en CRISPR Sam Sternberg, líder del grupo de desarrollo de tecnología en Caribou Biosciences Inc., con sede en Berkeley, California, que está desarrollando soluciones basadas en CRISPR para la medicina. agricultura e investigación biológica.

Éstos son algunos de los hallazgos más recientes:

  • En abril de 2017, un equipo de investigadores publicó una investigación en la revista Science de que habían programado una molécula CRISPR para encontrar cepas de virus, como el Zika, en suero sanguíneo, orina y saliva..
  • El 2 de agosto de 2017, los científicos revelaron en la revista Nature que habían eliminado un defecto de enfermedad cardíaca en un embrión con éxito utilizando CRISPR..
  • El 2 de enero de 2018, los investigadores anunciaron que podrían detener los hongos y otros problemas que amenazan la producción de chocolate utilizando CRISPR para hacer que las plantas sean más resistentes a las enfermedades..
  • El 16 de abril de 2018, los investigadores actualizaron CRISPR para editar miles de genes a la vez, según una investigación publicada por la revista BioNews..

Información adicional de Alina Bradford, colaboradora.

Recursos adicionales

  • Broad Institute: una cronología del trabajo fundamental en CRISPR
  • Noticias de ingeniería genética y biotecnología: CRISPR-Cas9 mejorado 10000 veces por nucleótidos sintéticos
  • Broad Institute: Preguntas y respuestas sobre CRISPR



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